干貨 | 皮下成瘤實驗解析
手拿把掐教你使用基質膠！
GelNest?基質膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。這些成分可以提供細胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號，同時也可以模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，提高細胞培養(yǎng)的成功率和效果。除了基底膜成分，GelNest?基質膠中還富含多種生長因子。這些生長因子可以促進細胞分化、增殖和遷移，從而進一步模擬生理環(huán)境中的細胞信號通路和互動。
GelNest?基質膠具有廣泛的應用前景，特別是在組織工程、細胞培養(yǎng)和研究等方面，可被用于類器官培養(yǎng)、干細胞分化、血管生成、遷移或侵襲和體內腫瘤發(fā)生等研究。
本文針對基質膠在裸鼠皮下成瘤實驗中的應用方法進行解析。
概述
皮下成瘤實驗一般選用4-8周齡的小鼠。倫理學通常要求接種腫瘤細胞數(shù)量不可超過1×107個/只。成瘤速度根據(jù)細胞的成瘤性、增殖速度、細胞接種量、小鼠品系等因素有所差異。藥物干預周期一般為0.5-2個月。
裸鼠是由于nu基因有獨特的遺傳特性，成為科學研究中具有巨大潛力的試驗模型。經過世界各國實驗動物遺傳育種學家的努力，已將nu基因導入不同近交系動物，成為系列動物模型，僅小鼠模型一種，已建立了二十余種近交系裸鼠。
常見成瘤細胞
較容易成瘤的細胞：
Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大細胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人黑色素瘤細胞），SGC7901 人胃腫瘤細胞 ，KB人口腔表皮樣癌細胞
可以成瘤但是比較慢的細胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（結腸癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌 ， CT26 （小鼠結腸癌細胞 ），SH-SY5Y (人神經母細胞瘤細胞 ) ， U251 （人膠質瘤細胞） ， BGC-823（人胃癌細胞） ，PC-3 （人前列腺癌細胞）
一些比較有爭議的細胞：
Hela（宮頸癌），HCT（人回盲腸癌細胞/人結直腸癌腺癌細胞）。
其他：
BMSC（骨髓間充質干細胞）
操作流程
（以Hep-G2細胞為例）
01
將Gelnest?基質膠（高濃度）置于冰中并在4℃過夜融化，使用預冷的移液管或吸頭混合基質膠至均勻狀態(tài)。
注：高濃度低因子基質膠的成瘤更快。
02
細胞收集：準備對數(shù)期生長的、細胞密度達80-90%左右的Hep-G2細胞，于收集細胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。胰酶消化細胞，待細胞變圓未脫離培養(yǎng)皿時，去除胰酶，加入無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液。收集的細胞懸液300×g離心5分鐘，PBS洗滌2次。PBS重懸細胞至終濃度為8×10^7個細胞/mL。將細胞置于冰上待用。
注：1.懸浮細胞直接收集細胞懸液，貼壁細胞用胰酶消化后收集細胞懸液。
2.收集的細胞宜在1小時內接種完畢。
03
將細胞懸液與基質膠在4℃環(huán)境下按照1:1的比例混勻，制備成終濃度為0.5×10^7-5×10^7個細胞/mL。
注：細胞懸液與基質膠混合液需置于冰上以減緩細胞凋亡并防止基質膠凝固。
04
使用實驗動物電動剃毛器對小鼠注射部位皮膚進行脫毛，然后用酒精棉球進行消毒。
消毒
05
用不帶針頭的1mL注射器將細胞懸液與基質膠混合液吸入注射器，再裝上針頭。
注：吸取混合液前可用注射器緩慢吹打以混勻細胞。
06
左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左側腋窩處皮下注射，接種時，針頭在皮下進針深一點，約1cm深，以減少注射后細胞懸液從針眼溢出。接種體積通常為100μL/只。
注：這一過程盡量在半小時內完成，途中細胞懸液放在冰上以減緩細胞凋亡及防止出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。
排空入針口
接種
接種后觀察
07
將裸鼠放回籠內繼續(xù)飼養(yǎng)，約1-3周可觀察到較明顯的瘤塊，并根據(jù)實驗設計在腫瘤體積不超過1000mm^3前對裸鼠進行安樂死，取出腫瘤，拍照。
腫瘤測量
腫瘤活體熒光
常見問題與解答
Q1：常見的荷瘤不成功可能的原因？
A：
（1）細胞的狀態(tài)是成瘤實驗的關鍵，所以細胞生長狀態(tài)一定要好，取處于對數(shù)生長期的細胞，細胞達80-90%左右密度為宜，收集細胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。需加入基質膠輔助或增大接種量或更換細胞系；
（2）可能是小鼠周齡太大，一般選擇5-6周齡裸鼠，小于4周可能不耐受過早死亡，大于6周免疫力會增強，不易成瘤。
（3）可能是小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（NSG（包括NOG、NCG，B-NDG等）＞Nod-scid小鼠＞Nude裸鼠）。
（4）接種部位也是成瘤實驗的重要因素。選擇血管豐富且易操作的部位接種，如腋下、腹股溝、側腹部及頸背部等部位，其中腋下中后部皮下較好，成瘤率高，比較推薦打腋下，一人操作很方便，后續(xù)量瘤子也很好操作。
Q2:腫瘤長起來后又消失的原因？
A：腫瘤生長過程中，如果出現(xiàn)腫瘤塊先縮小，后變大的現(xiàn)象，很可能是由于炎癥反應，腫瘤細胞被小鼠自身吸收造成的。
繼續(xù)觀察腫瘤細胞吸收之后是否經過幾周還能長出來，如若后續(xù)腫瘤依舊未長出來，可考慮更換免疫缺陷程度更大的小鼠。
Q3：造成腫瘤均一性很差的原因？
A：首先，并不是所有的腫瘤都能夠長得均一形態(tài)。腫瘤生長不宜過大，一般直徑不超過15mm，體積不超過2000mm^3
其次，如果同一分組內小鼠腫瘤體積差距很大，可能是由于小鼠的周齡及接種細胞量不一致造成的，建議重新接種。
Q4：是否可以應用免疫抑制劑加速腫瘤生長？
A：一般不建議加免疫抑制劑，有限考慮選擇免疫缺陷程度更高的小鼠品系。
一、質量控制介紹
二、選用指南
三、儲存及操作注意事項
GelNest?基質膠在分裝前可以保存于 -20℃冰箱。初次使用時，應融化后按照單次用量分裝，并保存于 -80° C 冰箱，有效期 2 年。注意不要使用無霜冰箱儲存 GelNest?基質膠。
GelNest?基質膠在 4℃下呈液態(tài)，在 37℃時會形成凝膠態(tài)，在溫度高于 10°C 時就會開始凝固成膠，請預冷移液吸頭并盡量在冰上操作。
