劃重點(diǎn):
1.iPSC培養(yǎng)過程中不建議使用抗生素,抗生素會影響細(xì)胞的活性和分化潛能。
2.iPSC培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)與其它細(xì)胞隔離,兩次傳代后檢測支原體。
01基質(zhì)膠用于多孔板的包被:
(1)將Gelnest?基質(zhì)膠(干細(xì)胞專用)置于冰中并在4℃融化,使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
注:GelNest?基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成,包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等,更含有多種多種生長因子。這些成分可以提供細(xì)胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號,模擬生理環(huán)境中基底膜的特性,從而進(jìn)一步模擬生理環(huán)境中的細(xì)胞信號通路和互動,提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和效果。
(2)在冰上,將基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)液按照1:80或1:100的比例混勻,例如取1mL基質(zhì)膠加入80mL或100mL DMEM培養(yǎng)液中,使用預(yù)冷的移液管混合至均勻狀態(tài)。
注:可根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整稀釋比例。
(3)將6孔板置于冰上,按照每孔1mL向6孔板中加入稀釋后的基質(zhì)膠。
(4)將6孔板置于37℃孵育過夜。
注:一般情況下,孵育1小時(shí)即可使用,但過夜孵育的細(xì)胞培養(yǎng)效果更好。
(5)使用前吸出未結(jié)合的基質(zhì)膠。
注:需確保移液管的尖端不會刮傷涂層表面。
02 Y-27632 (ROCK抑制劑)溶液的配制
將Y-27632 溶于PBS中,配制成10mM的Y-27632溶液,例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中,即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注:Y-27632的工作濃度為10μM。
03配制含Y-27632的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液(如mTeSR?1或TeSR?-E8?)
取Y-27632溶液與mTeSR?1培養(yǎng)液按照1:1000的比例混勻,例如取10μl Y-27632溶液加入10mL mTeSR?1培養(yǎng)液中,即得10mL含10μM Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
04 iPSC復(fù)蘇:
(1)將凍存的iPSC置于37℃水浴迅速解凍,將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,用DMEM培養(yǎng)液沖洗凍存管兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中,與管中細(xì)胞合并,室溫300×g離心5分鐘。
(2)棄上清,用2mL含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液重懸iPSC,隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板的1個(gè)孔中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注:建議將每支復(fù)蘇的細(xì)胞(約100萬個(gè))轉(zhuǎn)移至6孔板的1個(gè)孔中培養(yǎng)使細(xì)胞存活率最大化。
(3)第二天對iPSC進(jìn)行換液,將含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液更換為不含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
注:可使用耐思新推出細(xì)胞復(fù)蘇儀替代原始細(xì)胞復(fù)蘇過程,細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間短,細(xì)胞存活率高。
05 iPSC傳代:
注:iPSC細(xì)胞生長至單層后會迅速分化并死亡,為保持其活性和多能性,需在長滿前進(jìn)行傳代。
(1)去上清,用1mL PBS洗滌1次,加入1mL適當(dāng)?shù)募?xì)胞消化液
(2)將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育3分鐘。顯微鏡下觀察,大部分細(xì)胞脫落,若細(xì)胞仍附著,可以用手輕輕拍打培養(yǎng)板底部使細(xì)胞脫落。
(3)將消化下來的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,用DMEM培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)板表面兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中,與管中的細(xì)胞合并,室溫300×g離心5分鐘。
(4)棄上清,用含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液進(jìn)行重懸,隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
06iPSC凍存:
NEST生物樣本庫系列含有全規(guī)格細(xì)胞凍存管及凍存液,操作簡單,安全無菌。
(2)參考細(xì)胞凍存液的相關(guān)步驟進(jìn)行細(xì)胞消化。
(3)計(jì)數(shù),棄上清,加入適量凍存液,以每管1mL凍存液(約100萬個(gè)細(xì)胞)分裝至凍存管中。
(4)將細(xì)胞凍存管放置于可逐步降低溫度的NEST程序降溫盒內(nèi)并放置在-80℃冰箱內(nèi),確保冷卻速度約為1℃/分鐘。通常冷卻速度不宜快于0.5℃/分鐘。
(5)放置在-80℃冰箱內(nèi)約24小時(shí)后轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀嘀斜4妗?img src="http://cell-nest.bcdn8.com/Resource/editor/2023/12/01/1f1b2a9463f54ac78a03ffc66ef2fc36.png" style="max-width: 100%; height: auto;" data-filename="/">
iPS細(xì)胞的成功誘導(dǎo)給細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)研究開辟了全新的道路。相信在不久的將來,iPSC技術(shù)能快速突破瓶頸,NEST也將持續(xù)研發(fā)新品,推動再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展,為患者帶來新生的希望!