定義:
酶聯(lián)免疫吸附測定(簡寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
常用的ELISA可以分為五大類:直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA、競爭抑制ELISA。其他的ELISA都由這五類組合衍生。
所有的ELISA基本由基礎(chǔ)的幾個步驟組合而成:將抗原或抗體吸附到固相載體上;加入待檢樣品以及后續(xù)試劑;溫育;洗滌去掉游離未結(jié)合的反應(yīng)物;加入酶檢測底物;結(jié)果的判讀
分類:
1.直接ELISA
將抗原按一定的比例稀釋,包被到固相載體上,加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體,孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。直接ELISA中只經(jīng)過了一步信號放大,所以其靈敏度不是很高
2.間接ELISA
間接ELISA與直接ELISA不同的是,與包被好的抗原結(jié)合的是非酶標(biāo)抗體,另外再引入第二種抗體(即二抗)。二抗是經(jīng)過酶標(biāo)的,它可以與第一種抗體特異性結(jié)合,最后加入底物顯色并判讀結(jié)果。在檢測抗體的效價、血清的效價以及單克隆抗體的篩選過程中,間接ELISA都是非常重要的實(shí)驗過程。
3.夾心ELISA
3.1直接夾心ELISA
3.1.1雙抗體夾心ELISA
將第一種抗體(捕獲抗體)包被在固相載體上,封閉后加入待檢抗原,溫育后加入第二種抗體(檢測抗體),捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗,也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗,但是檢測抗體需要經(jīng)過酶標(biāo)。
3.1.2雙抗原夾心ELISA
原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同,不同的是包被的是抗原,待檢對象是抗體,然后加入酶標(biāo)抗原,再加底物顯色。雙抗原夾心ELISA利用特異性的抗原代替酶標(biāo)二抗,所以特異性比間接法更好。另外,由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG,而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出,因此,雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。
3.2間接夾心ELISA
間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA,其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上(作為捕獲抗體),封閉,加入待檢抗原,溫育,洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體(非酶標(biāo),作為檢測抗體),最后加入酶標(biāo)二抗(特異性識別檢測抗體),再加底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比,其中引入了特異性識別檢測抗體的酶標(biāo)二抗,相當(dāng)于整個體系的信號增加了一步放大系統(tǒng),最終的結(jié)果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。
4.競爭ELISA
將特異性抗體吸附于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液;而另一組只加酶標(biāo)記抗原,再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可,因此,對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。
5.競爭抑制ELISA
預(yù)先將抗原包被在固相載體上,實(shí)驗時加入稀釋好的待檢抗原(或抗體),然后依次加入特異性的抗體以及此抗體對應(yīng)的酶標(biāo)二抗。待檢標(biāo)本中的抗原(或抗體)就和預(yù)制備體系中固相載體上結(jié)合的抗原(或抗體)競爭結(jié)合特異性的抗體(或固相載體上結(jié)合的抗原)。洗掉被競爭的特異性抗體,最后加底物顯色。最終顯色的結(jié)果與待檢抗原(或抗體)量呈反比。
實(shí)驗材料:
96孔高吸附酶標(biāo)板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]
單通道移液槍、多通道移液槍
微量離心管[NEST]
顯色液(A/B液)
15/50ml離心管[NEST]
洗液(PBST)
終止液(H2SO4)
BSA蛋白
稀釋液(PBS)
包被液(CB)
全波段酶標(biāo)儀
恒溫箱
實(shí)驗流程:
以使用比較廣泛的間接ELISA為例,簡述實(shí)驗過程
1.抗原包被:
將對應(yīng)抗原用CB稀釋至1ug/ml,加入96孔酶標(biāo)板孔中,每孔100ul,4℃包被過夜,之后進(jìn)行下一步驟。若實(shí)驗時間比較緊張,包被后可放置恒溫箱內(nèi),37℃包被3h后即可進(jìn)行下一步操作。
2.洗板:
將酶標(biāo)板內(nèi)的包被液甩干,用洗液(PBST——0.2%的吐溫20 PBS)清洗酶標(biāo)板2次,并拍干板內(nèi)液體,使之無余液殘留。
3.封閉:
用PBS充分溶解BSA蛋白制備成封閉液(體積比為5~10%),將封閉液加入酶標(biāo)板孔中,每孔150ul,恒溫箱37℃封閉1h。若實(shí)驗時間安排充裕,可在4℃條件下封閉過夜。
【若抗原內(nèi)含有偶聯(lián)BSA分子,則更換封閉成分,可用羊血清代替】
4.洗板:
將酶標(biāo)板內(nèi)的封閉液液甩干,用洗液(PBST)清洗酶標(biāo)板2次,并拍干板內(nèi)液體,使之無余液殘留。
【若暫無使用需求,可將包被后的酶標(biāo)板放置-20℃條件下儲存,需要時解凍使用即可?!?span lang="EN-US">
5.一抗:
用PBS稀釋液將待檢樣品(含有對應(yīng)抗原的抗體)按需求稀釋,再將稀釋后樣本加入包被好的酶標(biāo)板中,每孔100ul,陰性對照孔加入100ulPBS稀釋液,在恒溫箱中37℃孵育1h。
6.洗板:
將酶標(biāo)板內(nèi)的一抗甩干,用洗液(PBST)清洗酶標(biāo)板3次,并拍干板內(nèi)液體,使之無余液殘留。
7.二抗:
用PBS稀釋液按照說明,稀釋對應(yīng)的酶標(biāo)二抗,將稀釋完成的二抗加入一抗孵育完成的酶標(biāo)板中,每孔100ul,恒溫箱37℃孵育30min。
8.洗板:
將酶標(biāo)板內(nèi)的二抗甩干,用洗液(PBST)清洗酶標(biāo)板4次,并拍干板內(nèi)液體,使之無余液殘留。
9.顯色:
將顯色液A/B液等體積混合,配置成顯色液,加入二抗孵育完成的酶標(biāo)板中,每孔100ul,恒溫箱避光37℃反應(yīng)5~10min。
【顯色液現(xiàn)配現(xiàn)用,不可提前配置】
10.終止與讀數(shù):
顯色完成后,無須丟棄顯色液,直接加入終止液(H2SO4)終止反應(yīng),每孔50ul,隨即轉(zhuǎn)移至全波段酶標(biāo)儀450nm單波長度數(shù),或450nm/620nm雙波長讀數(shù),讀書完成后處理數(shù)據(jù)。
使用到的NEST產(chǎn)品:
96孔高吸附酶標(biāo)板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]
微量離心管[NEST]
15/50ml離心管[NEST]